Le choix de l’amorce du gène de l’ARNr 16S a un impact

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 12577 (2023) Citer cet article

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Le séquençage d’amplicons d’ARNr 16S ou, plus récemment, l’analyse métatranscriptomique sont actuellement les seules méthodes privilégiées pour le profilage microbien d’échantillons contenant un rapport prédominant d’ADN humain/bactérien. Cependant, en raison de l’amplification hors cible de l’ADN humain, les protocoles actuels sont inadéquats pour les échantillons bioptiques. Nous présentons ici une méthode efficace, fiable et abordable pour l’analyse des bactériomes d’échantillons cliniques où la teneur en ADN humain prédomine. Nous avons déterminé le profil du microbiote sur un total de 40 biopsies humaines de l'œsophage, de l'estomac et du duodénum en utilisant le séquençage d'amplicons d'ARNr 16S avec les amorces 515F-806R (V4) largement utilisées ciblant la région V4, les amorces 68F-338R et un ensemble modifié de Amorces 68F-338R (V1-V2M) ciblant la région V1 – V2. Avec les amorces V4, en moyenne 70 % des variantes de séquence d’amplicons (ASV) sont cartographiées sur le génome humain. En revanche, cette amplification hors cible était absente lors de l’utilisation des amorces V1 – V2M. De plus, les amorces V1 – V2M offraient une richesse taxonomique et une reproductibilité de l'analyse significativement plus élevées que les amorces V4. Nous concluons que la méthode de séquençage de l’ARNr V1 – V2M 16S est fiable, rentable et applicable aux échantillons humains peu abondants en bactéries dans la recherche médicale.

Au cours de la dernière décennie, l’étude du bactériome humain à l’aide de méthodes de séquençage à haut débit indépendantes de la culture est devenue l’une des techniques les plus fréquemment utilisées pour étudier les communautés bactériennes habitant une grande variété de niches dans le corps humain1,2. L'accès aux technologies de troisième génération, associé à la diminution des coûts associés au séquençage à haut débit, a entraîné une transition du séquençage du gène de l'ARNr 16S de l'amplicon vers le séquençage du gène de l'ARNr 16S complet et le séquençage métagénomique/métatranscriptomique dans des échantillons comme les selles, le vagin humain3 ou des écouvillons provenant de la peau ou la cavité buccale4 qui contiennent un rapport prédominant d’ADN humain/bactérien. Cependant, dans les échantillons contenant de faibles concentrations d’ADN bactérien ou ceux « contaminés » par l’ADN de l’hôte comme le sang, l’urine ou les échantillons de biopsie humaine, le profilage du bactériome repose encore en grande partie sur le séquençage du gène de l’ARNr 16S. Étant donné que la quantité de données générées est relativement faible, elle ne nécessite pas d’analyse bioinformatique complexe5 et le prix est également plus abordable. D'autre part, les résultats du séquençage des amplicons de l'ARNr 16S dépendent essentiellement du choix de sous-régions hypervariables parmi les neuf régions variables disponibles disséminées dans la séquence génétique hautement conservée de l'ARNr 16S, ainsi que de la qualité des informations récupérées ainsi que de la taxonomie. la précision peut varier considérablement en fonction du ou des jeux d’amorces utilisés6. Actuellement, la grande majorité des études ciblent soit la région variable unique V4 comme dans le protocole standardisé largement adopté du Earth Microbiome Project (EMP)7, soit les régions variables V1-V38 ou V3-V59 comme dans le protocole à double indexation du microbiome humain. Projet (HMP). Cela est principalement dû au fait que la plateforme de séquençage Illumina, largement utilisée, ne produit que des séquences courtes (NextSeq, MiniSeq, iSeq ≤ 300 bases et MiSeq ≤ 600 bases). Malheureusement, des études récentes ont montré à plusieurs reprises que la sous-région V4 du gène de l’ARNr 16S, communément ciblée, évalue avec moins de précision les taxons couramment présents dans le corps humain6,10,11. De plus, avec la région V3 à V5, elle est particulièrement sensible à l'amplification hors cible de l'ADN humain12, en particulier dans les échantillons de biopsie, ce qui entraîne la perte potentielle de taxons rares et de résolution bactérienne, ce qui entraîne le gaspillage d'une proportion importante de données.

Nous démontrons ici un nouveau protocole utilisant un ensemble d'amorces ciblant la sous-région du gène de l'ARNr 16S V1 – V2 qui diminue considérablement l'amplification hors cible de l'ADN humain dans les échantillons de biopsie de l'œsophage, de l'estomac et du duodénum, ​​tout en augmentant considérablement la diversité alpha et taxonomique. précision par rapport aux amorces couramment utilisées ciblant la région V4. Les amorces d'amplification pour la région V1-V2, y compris les fonctionnalités requises pour le séquençage (adaptateurs et indices de Flow Cell), ont été optimisées pour la plateforme Illumina MiniSeq avec une longueur de lecture maximale de 150 pb, offrant une option rentable pour tout laboratoire intéressé à effectuer séquençage à haut débit du gène de l’ARNr 16S. Pour augmenter encore les performances des classifications taxonomiques, nous avons inclus la concaténation de lectures appariées dans le pipeline bioinformatique13.