Profilage de l'enveloppe cellulaire | Groupe de peignes à pointe du Guangdong

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 4815 (2023) Citer cet article

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L'enveloppe cellulaire des bactéries Gram-négatives appartenant au complexe Burkholderia cepacia (Bcc) présente des restrictions uniques à la pénétration des antibiotiques. En conséquence, les espèces Bcc sont connues pour provoquer des infections multirésistantes récalcitrantes chez les individus immunodéprimés. Nous présentons ici les résultats d’un criblage à l’échelle du génome des déterminants de résistance et de susceptibilité associés à l’enveloppe cellulaire dans un isolat clinique de Burkholderia cenocepacia. À cette fin, nous construisons une bibliothèque de mutants de transposon à code-barres aléatoires à haute densité et l’exposons à 19 antibiotiques ciblant l’enveloppe cellulaire. En quantifiant la condition physique relative des mutants avec BarSeq, suivie d'une validation avec interférence CRISPR, nous profilons plus d'une centaine d'associations fonctionnelles et identifions les médiateurs de la sensibilité aux antibiotiques dans l'enveloppe cellulaire Bcc. Nous révélons des liens entre la sensibilité aux β-lactamines, la synthèse du peptidoglycane et les blocages du métabolisme de l'undécaprényle phosphate. La synergie de l’association β-lactame/inhibiteur de β-lactamase, ceftazidime/avibactam, est principalement médiée par l’inhibition de la carbapénémase PenB. Par rapport à la ceftazidime, l'avibactam potentialise plus fortement l'activité de l'aztréonam et du méropénème dans un panel d'isolats cliniques Bcc. Enfin, nous caractérisons dans Bcc l’activité dépendante du fer et des récepteurs de l’antibiotique sidérophore-céphalosporine, le céfidérocol. Nos travaux ont des implications pour la priorisation des cibles antibiotiques et pour l’utilisation de combinaisons supplémentaires d’inhibiteurs de β-lactame/β-lactamase qui peuvent étendre l’utilité des thérapies antibactériennes actuelles.

La résistance aux antimicrobiens constitue une menace majeure pour la santé publique mondiale. En 2019, on estime que 4,95 millions de décès étaient associés à des infections pharmacorésistantes1, et ce bilan devrait encore s’alourdir à l’avenir2. Les bactéries Gram-négatives arrivent régulièrement en tête de liste des priorités pour le développement d’antibiotiques, car elles sont l’une des principales causes d’infections résistantes aux antibiotiques3.

Un facteur important de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries à Gram négatif réside dans la composition à double membrane de leur enveloppe cellulaire. La membrane externe est une bicouche asymétrique composée de phospholipides sur le feuillet interne et de lipopolysaccharide (LPS), décoré d'unités d'antigène O, sur le feuillet externe. L'asymétrie est maintenue par l'action de la voie Mla, qui transporte les phospholipides en excès de la membrane externe vers la membrane interne4. Ensemble, les membranes interne et externe ont des exigences de perméabilité orthogonales : les petits composés hydrophiles (généralement <600 Da5) sont capables de diffuser à travers les porines remplies d'eau de la membrane externe, tandis que les composés hydrophobes sont capables de diffuser à travers la membrane interne6. Le sacculus du peptidoglycane n’est pas impliqué dans la perméabilité de l’enveloppe en soi, mais remplit plutôt la fonction essentielle de maintien de la forme cellulaire et de l’intégrité structurelle7. De nombreux composants de l’enveloppe cellulaire bactérienne sont essentiels et n’ont pas d’homologue chez l’humain ; ils constituent donc des cibles attractives pour une variété d’antibiotiques. De plus, l’utilisation de potentialisateurs à petites molécules a gagné du terrain comme moyen d’augmenter la perméabilité membranaire et l’activité d’autres antibiotiques8.

Les bactéries du genre Burkholderia sont connues pour leurs niveaux élevés de résistance intrinsèque aux antibiotiques, dus en partie aux caractéristiques uniques de l’enveloppe cellulaire9. Parmi eux, la lignée connue sous le nom de complexe Burkholderia cepacia (Bcc) est constituée d’agents pathogènes opportunistes qui infectent principalement les individus immunodéprimés. Certaines espèces, comme B. cenocepacia, peuvent provoquer une forme de pneumonie et de bactériémie connue sous le nom de syndrome cepacia10. Une résistance quasi uniforme à plusieurs classes d’antibiotiques limite considérablement les options de traitement11,12, et les protocoles d’éradication nécessitent souvent des semaines, voire des mois, de cocktails d’antibiotiques13,14. En outre, bien que de nouveaux traitements soient disponibles pour traiter les symptômes de la mucoviscidose (par exemple les modulateurs CFTR), leur bénéfice pourrait être limité dans l'élimination des agents pathogènes15, mais cela n'a pas encore été évalué pour l'infection par Bcc.

600 Da)5,8. We expected the large scaffold antibiotics to highlight chemical-genetic interactions in cell envelope permeability and disruptions in major cell envelope biogenesis mechanisms. In summary, we aimed to study cell envelope-associated chemical-genetic interactions and how they may be exploited to inform antibiotic combinations./p> 0.05) from a two-sided t-test. Further details can be found in the Methods. D Correlation of average gene fitness scores in the Mla pathway (mlaFEDvacJ and mlaCB) from the BarSeq experiment with antibiotic molecular weight. The points are coloured by average Mla pathway gene fitness score from three biological replicates; error bars represent SD. The lines show a linear regression with all antibiotics (solid) vs. without PMB and BAC (dashed). Shown by each line is the Spearman’s rank correlation coefficient (ρ) and P-value. E Ratios of NPN fluorescence (a measure of outer membrane permeability) of the CRISPRi mutants in inducing (0.5% rhamnose) vs uninducing (0% rhamnose) conditions. Error bars represent means ± SD of six biological replicates. Significance was determined by 1-way ANOVA with Dunnett’s post hoc test to the non-targeting control sgRNA (NTC). ***P < 0.001. Exact P-values are 2.7 × 10-6 (mlaFEDvacJ) and 5.1 × 10-5 (mlaCB). The dashed line indicates an NPN fluorescence ratio of 1. F Summary of antibiotic checkerboard interaction assay with CHX. Interactions were assessed and interpreted with SynergyFinder as per the Methods. Source data are provided as a Source Data file./p> 0.05) from a two-sided t-test. Further details can be found in the Methods. B Ratios of NPN fluorescence of the CRISPRi mutants in inducing vs uninducing conditions. Error bars represent means ± SD of four biological replicates. Significance was determined by 1-way ANOVA with Dunnett’s post hoc test to the non-targeting control sgRNA (NTC). *P < 0.05; ***P < 0.001. Exact P-values are 1.8 × 10-12 (hldD) and 0.019 (ispDF). The dashed lines indicate a NPN fluorescence ratio of 1. C Summary of the major UndP(P) metabolic pathways in B. cenocepacia (from experimental evidence and inferred by homology), annotated with proteins names if they are known126,127,128,129,130. UndPP is synthesized in the cytoplasm by the methylerythritol phosphate (MEP) pathway. UndP is a lipid carrier for construction of the O-antigen, peptidoglycan building blocks (in the form of lipid I and II), and the protein O-glycan. After use as a carrier, UndPP is liberated and recycled into UndP on the cytoplasmic leaflet. IM inner membrane, OM outer membrane, GTase glycosyltransferase. Image created with BioRender. D Antibiotic dose responses (µg mL-1) of growth of CRISPRi mutants with or without induction with 0.5% rhamnose. Values are normalized to the OD600 of growth without antibiotic and are means of three biological replicates. NTC non-targeting control sgRNA. E Summary of antibiotic checkerboard interaction assay with PF-04. Interactions were assessed and interpreted with SynergyFinder as per the Methods. Source data are provided as a Source Data file./p> 0.05) from a two-sided t-test. Further details can be found in the Methods. B Rationale for identifying targets of AVI. If a target is disrupted with a transposon or repressed with CRISPRi there will be no change in β-lactam MIC when AVI is added. Image created with BioRender. C MIC values of K56-2::dCas9 harbouring plasmids expressing a non-targeting sgRNA control (NTC) or an sgRNA targeting the indicated genes. MIC values are medians of three biological replicates, with bold indicating change versus the NTC. † Fold MIC is the ratio of the MIC -AVI to the MIC + AVI. * AVI kept constant at 8 µg mL-1. D Nitrocefin hydrolysis assay of lysate from CRISPRi mutants grown in the indicated conditions. Data are presented as mean values of five biological replicates ± SD, with the dashed line indicating no difference vs. the NTC. Significance was determined by an unpaired two-tailed t-test to the NTC grown without rhamnose or AVI using Bonferroni’s correction. ***P < 0.001. Source data are provided as a Source Data file./p>256 µg mL-1 for AZT; 0.5 – 32 µg mL-1 for MEM; 2 – >128 µg mL-1 for CAZ (Supplementary Data 2). Overall, potentiation by AVI was strongest for AZT and MEM (up to 64-fold MIC reduction) (Fig. 7A). These trends are in line with the changes in susceptibility upon blaPenB knockdown in K56-2 (Fig. 6C). Consequently, and in the context of clinical breakpoints, 24/41 of the Bcc isolates were resistant to AZT without AVI, which was reduced to 2/41 with AVI (Fig. 7B). For MEM and CAZ, 9/41 and 4/41 of the Bcc isolates were resistant without AVI, respectively, and all Bcc isolates were sensitive with AVI (Fig. 7B)./p>4 µg mL−1) as none exist for the Bcc. Source data are provided as a Source Data file./p>100 µM) in CAMHB, the MIC was 4-fold higher (Fig. 8D). These effects reflect the different initial iron concentrations in rich CAMHB and defined M9 + CAA, where adding small amounts of iron equilibrate CFD susceptibility between CAMHB and M9 + CAA. These findings are in agreement with the importance of iron for CFD susceptibility./p> 256 µg mL-1 in WT). The peak sputum concentration of some inhaled colistin therapies is above 300 µg mL-1 sputum97, well above the inhibitory concentration for a mutant lacking DbcA. It is tempting to suggest that DbcA, and UndP recycling more broadly, may be a linchpin in both β-lactam and cationic antibiotic resistance in Burkholderia. Thus, inhibiting UndP recycling with a small molecule may potentiate the activity of multiple clinically available antibiotics./p>80%) GC-content. Each gene was typically targeted by two different sgRNAs within the 5’ most 75 bp, and the results of the mutant that displayed the stronger phenotype were reported. The silencing effect for each mutant was measured by qRT-PCR (see below) and is reported in Supplementary Table 2./p>

75 molecules of genome per mutant per tube. We observed a minor secondary product (<10%) at 315 bp on TapeStation 4150 traces (Agilent Technologies). Thus, for each condition, 200 µL of raw BarSeq PCR product was pooled and subjected to two rounds of dual size selection with Sera-Mag Select (Cytiva) magnetic beads to purify the desired product at 196 bp. The primers were designed with Nextera-type tagmentation sequences as for the RB-TnSeq-circle sequencing primers, except that the 8 bp standard Nextera indexes were replaced with 10 bp Unique Dual Indexes (primers 2163 – 2255, Table 3). Each product was amplified with a unique i5 and i7 index, enabling greater multiplexing flexibility and higher confidence in correcting up to 2 bp errors during indexing read sequencing. Up to 24 samples were indexed together for runs of a NextSeq 550 in high-output mode (Donnelly Centre, Toronto, Canada) with reagent kit v2.5 and 20% PhiX spike, generating 410–510 million 30 bp single-end reads each. A custom sequencing recipe was used for dark-cycling during the first 18 bases, covering the flanking primer region, with the read output starting at the beginning of the barcode and extending 10 bp into the other flanking priming region./p>0.5 or <−0.5 were considered for further analysis. To support these findings, we performed extensive follow-up validations using CRISPRi mutants for many of the effects we observed in the BarSeq data. Pearson’s correlation with two-tailed p-values was used to assess the relationship between gene fitness values in AVI/CAZ and the single conditions in the combination. The NPN outer membrane permeability assay was analysed by 1-way ANOVA with a Dunnett’s multiple comparison test, with K56-2::dCas9 bearing the non-targeting sgRNA (or without for the deletion mutants) set as the reference. β-lactamase assay data was compared by unpaired two-tailed t-tests and adjusted using Bonferroni’s multiple testing correction./p>