Développement d’acide nucléique peptidique

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 12482 (2023) Citer cet article

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De nombreuses nouvelles méthodes de détection des pathogènes d’origine alimentaire ont été largement développées pour garantir la sécurité alimentaire. Parmi les bactéries alimentaires importantes, Bacillus cereus a été identifiée comme un agent pathogène préoccupant qui provoque diverses maladies alimentaires, ce qui a suscité l'intérêt de développer des méthodes de détection efficaces pour cet agent pathogène. Bien qu’une méthode standard basée sur la culture et des tests de confirmation biochimiques soit disponible, elle demande beaucoup de temps et de main d’œuvre. Des méthodes alternatives basées sur la PCR ont été développées mais manquent de capacité à haut débit et de facilité d'utilisation. Cette étude tente donc de développer une méthode robuste pour la détection de B. cereus en exploitant les acides nucléiques pyrrolidinylpeptides (PNA) hautement spécifiques comme sondes pour une méthode de réseau de billes avec une capacité multiplex et à haut débit. Dans cette étude, les PNA portant le squelette de l'acide prolyl-2-aminocyclopentanecarboxylique (ACPC) avec les séquences d'ARNr groEL, motB et 16S ont été couplés de manière covalente à trois ensembles de billes à code-barres fluorescent pour détecter les trois gènes de B. cereus. Le réseau de billes développé à base d'acpcPNA présentait une bonne sélectivité, seuls les signaux étant détectables en présence de B. cereus, mais pas pour les autres espèces. La sensibilité de ce test de billes basé sur l'acpcPNA dans la détection de l'ADN génomique s'est avérée être de 0,038, 0,183 et 0,179 ng pour l'ARNr groEL, motB et 16S, respectivement. Cette performance était clairement supérieure à celle de son homologue ADN, confirmant ainsi une force de liaison beaucoup plus forte de l'acpcPNA sur l'ADN. La robustesse de la méthode développée a été démontrée en testant du lait artificiellement enrichi et des feuilles de moutarde marinées avec une interférence minimale des paramètres alimentaires. Par conséquent, il a été prouvé que cette méthode de preuve de concept basée sur l’acpcPNA et la matrice de billes constitue une méthode alternative efficace basée sur l’acide nucléique pour les agents pathogènes d’origine alimentaire.

Bacillus cereus est l'un des principaux agents pathogènes d'origine alimentaire que l'on peut trouver dans une large gamme de produits alimentaires allant des aliments prêts à consommer, aux aliments fermentés et aux produits laitiers1. En raison de sa tolérance aux pH et températures extrêmes, B. cereus était couramment trouvé à différentes étapes de la transformation des aliments2, entraînant de graves épidémies d'origine alimentaire dans le monde avec une prévalence globale pouvant atteindre 23,746 %. En Europe, c'est la deuxième cause d'épidémie d'origine alimentaire après Staphylococcus aureus3. Aux États-Unis, environ 63 000 personnes par an sont tombées malades avec un taux d'hospitalisation de 0,4 % du groupe Bacillus4.

Des méthodes rapides et précises permettant une surveillance et une détection rapides de B. cereus dans les aliments peuvent constituer une méthode d'atténuation clé pour réduire ses épidémies. De plus, étant donné que toutes les espèces de Bacillus ne sont pas pathogènes, il est impératif de pouvoir les identifier au niveau des espèces de Bacillus5. Bien qu'une méthode standard ISO 7932:2004 soit disponible, basée sur un protocole de comptage sur plaque de gélose6, cette méthode est longue et fastidieuse (nécessitant jusqu'à 24 heures d'incubation à 30 °C avec 2 à 7 jours supplémentaires pour la confirmation). test) et nécessite des professionnels formés. Des méthodes moléculaires alternatives telles que des techniques basées sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) ont été développées afin d'identifier B. cereus7,8. Cependant, la plupart de ces méthodes basées sur la PCR reposent sur des méthodes d’électrophorèse sur gel à basse résolution pour visualiser les produits de PCR, ce qui les rend difficiles à interpréter les résultats. De nombreuses techniques avancées basées sur la PCR, telles que la PCR quantitative (qPCR) et la PCR multiplex, ont donc été développées pour surmonter ces limitations9,10,11, mais leur capacité multiplexe est encore limitée en raison de la complication liée à la formation de dimères d'amorces12. En outre, la plupart des méthodes basées sur la PCR dépendent de l’ADN comme sonde spécifique, qui peut être dégradée par des facteurs environnementaux tels que la température, le pH et les enzymes.

Pour surmonter ces limitations, cette étude présente une méthode de détection de B. cereus en combinant les avantages de la capacité multiplexe et de la facilité d'acquisition des résultats à partir de la technique de réseau de billes, et de l'acide nucléique peptidique (PNA) hautement spécifique comme sonde alternative. La plate-forme de réseau de billes utilisée dans cette étude est basée sur une technologie xMAP à haut débit, sensible et multiplex pour différents types de cibles13,14. Cette méthode utilise des billes paramagnétiques à code-barres fluorescentes fonctionnalisées avec des groupes carboxyle pour la fixation covalente de ligands nucléophiles. Chaque ensemble de billes peut être identifié par un laser rouge et le signal est mesuré à partir d'un rapporteur fluorescent (R-phycoérythrine) par un laser vert13,15,16. Par rapport aux techniques traditionnelles de puces à ADN, la technologie des puces à ADN offre plusieurs avantages. Premièrement, le débit de cette technique est nettement supérieur. En effet, elle est considérée comme semi-automatique, contrairement à la technologie des puces à ADN. Deuxièmement, en raison de son étape de lavage automatique, la technologie des puces à ADN présente généralement un bruit de fond plus faible et une cohérence plus élevée que la technologie des puces à ADN17. Enfin, le coût d’un détecteur utilisant la technologie des billes est beaucoup moins cher que celui de la puce à ADN, ce qui le rend plus pratique. Ainsi, divers systèmes de réseaux de billes basés sur l'ADN ont été appliqués avec succès pour détecter une grande variété de contaminations alimentaires telles que les allergènes alimentaires18, les agents pathogènes d'origine alimentaire présents dans la viande de poulet19 et quatre agents pathogènes d'origine alimentaire, notamment Salmonella Typhimurium, Brucella spp., B. cereus et Shigella. spp. dans les produits laitiers20. Il est intéressant de noter que la méthode rapportée pour la détection de B. cereus nécessitait une température élevée à 38 ° C pour obtenir un signal détectable, probablement en raison d'une moindre stabilité de la liaison ADN-ADN par rapport à la liaison PNA-ADN. Cela le rend peu pratique pour un traitement industriel réel20. De plus, toutes ces méthodes de réseau de billes rapportées utilisaient l'ADN comme sonde spécifique, dont la spécificité dépend de manière significative de la température d'hybridation et de la longueur des sondes21. Nous avons supposé que l’utilisation d’autres imitateurs d’acide nucléique présentant une meilleure affinité de liaison à la cible de l’ADN pourrait améliorer les performances globales de détection.